ויטמין B12 בצמחים

האם ויטמין B12 קיים בצמחים? רבים טוענים כי ויטמין B12 הוא נקודת התורפה של התזונה הטבעונית, ושהוויטמין קיים באופן טבעי רק במזון מן החי. להלן עבודת גמר לקבל תואר בוגר במדעים (.B.Sc) שנכתבה ע"י סטודנט מאחת האקדמיות בארץ, שסקרה עשרות מחקרים מהעת האחרונה ומראה כי: לצמחים יש יכולת ביולוגית מוכחת לספוג ויטמין B12 דרך השורשים וקיימים צמחים רבים שחיים בסימביוזה עם החיידקים שמייצרים ויטמין B12, וכתוצאה מכך יש מזונות צמחיים שעשירים בוויטמין B12. * אין בפרסום העבודה באתר "30 בננות ליום" לשלול את הצורך בנטילת תוספי ויטמין B12 במידה ויש בהם צורך.

תקציר

ויטמין B12 הוא נוטריאנט חיוני לבני אדם ולכל בעלי החיים, מיוצר אך ורק על ידי פרוקריוטים ומשמש כקו-אנזים במסלולים מטבוליים שונים.

על פי הערכות, לכ-40% מהאוכלוסייה יש רמה נמוכה עד גבולית של ויטמין B12. מעל גיל 60, 10%-15% מהאנשים סובלים מבעיות בריאותיות שקשורות למחסור בוויטמין B12.

מסיבות שונות, מזונות מן החי ותוספי תזונה לא מספקים את הכמות הנדרשת של הוויטמין, אך קיים פוטנציאל גדול להגדלת הצריכה של הוויטמין ממזונות צמחיים שונים.

המחקרים

1. בדיקת ריכוז ויטמין B12 בעלי חסה שגדלו בתמיסה הידרופונית עם תוספת מלאכותית של הוויטמין.

2. בדיקת המסלול לסינתזה של ויטמין B12 בחיידקי קרקע שחיים בסימביוזה עם צמחים.

3. בדיקת מערכת היחסים הסימביוטית בין אצות שצורכות ויטמין B12 לחיידקים שמסנתזים את הוויטמין.

1. ויטמין B12 – מבנה ותפקוד

א. מבנה כימי

ויטמין B12 (משקל מולקולרי 1355.4) הוא רכיב מזון חיוני לכל בעלי החיים ששייך לקבוצת ה"קורינואידים", שכוללת תרכובות שמכילות טבעת קורין – אטום קובלט שמוקף בארבעה אטומי חנקן.

תרשים 1: מבנה טבעת קורין [מקור: ויקיפדיה]

המונח ויטמין B12 מגדיר בדרך כלל ציאנוקובלמין, הצורה הלא-טבעית אך היציבה ביותר מבחינה כימית של קובלמין, שקיימת ברוב תוספי התזונה, ובה הליגנד העליון של הקובלט בטבעת הקורין הוא CN. הצורות האחרות של קובלמין – מתילקובלמין, הידרוקסיקובלמין, 5-דאוקסיאדנוזילקובלמין – מובחנות על פי הליגנד העליון.(1)

תרשים 2: מבנה מולקולת קובלמין על פי הליגנד העליון

תאי בעלי חיים יכולים להמיר בקלות ציאנוקובלמין לצורות אחרות של קובלמין, על פי הצורך, בתוך הפראוקסיזום. עם זאת, קיימים גם קורינואידים שאינם פעילים ביולוגית בבעלי חיים, שבהם הליגנד התחתון של הקובלט אינו 6,5-דימתילבנזימידזול. מבנים אלה נחשבים לחייקני ויטמין B12, או פסבדו-ויטמין B12.י(2)

תרשים 3: (1) ציאנוקובלמין; (2)-(8) מבנים לא פעילים שונים

ב. תפקיד ויטמין B12 בתאי בעלי חיים

מתילקובלמין הוא קו-אנזים של האנזים מתיונין סינתאז, שממיר את חומצת האמינו הומוציסטאין למתיונין, במסלול ביוכימי החיוני לתהליכים פיזיולוגיים רבים שדורשים שכפול תאים מהיר, כמו בייצור תאי דם אדומים, וכן לייצור פורינים ופירמידינים בסינתזת הדנ"א.(3)

תרשים 4: מעורבות מתיונין סינתאז (MS) והקו-אנזים שלו מתילקובלמין בסינתזת הדנ"א [מקור: ויקיפדיה]

5-דאוקסיאדנוזילקובלמין משמש כקו-אנזים לאנזים מתילמלוניל-CoA מותאז, שמעורב במטבוליזם במיטוכונדריה של חומצות אמינו מסועפות וחומצות שומן עם מספר אי-זוגי של פחמנים, שאינן חלק ממסלול חמצון ביתא, והמטבוליזם שלהן חיוני לייצור מעטפות המיאלין של הנוירונים ועל כן להעברה תקנית של אותות עצביים.(3)

תרשים 5: מעורבות מתילמלוניל-CoA מותאז (MUT) והקו-אנזים שלו 5-דאוקסיאדנוזילקובלמין במטבוליזם של חומצות שומן [מקור: ויקיפדיה]

ג. סינתזה וצריכה של ויטמין B12

סינתזה של ויטמין B12 מתרחשת אך ורק אצל חיידקים וארכאה (חיידקים קדומים) וטרם נמצא יצור איקריוטי כלשהו שמסוגל לסנתז את הוויטמין. לא כל החיידקים מייצרים קובלמין, וחלקם, כמו אי-קולי, מנצלים את הוויטמין למטבוליזם. כל מיני בעלי החיים זקוקים לוויטמין B12 ממקור חיידקי, בגלל האנזים מתיונין סינתאז שפעילותו תלויה בקובלמין (MetH). לעומתם, צמחי יבשה ופטריות אינם זקוקים לקובלמין, בגלל נוכחות מתיונין סינתאז שאינו תלוי קובלמין (MetE – שיעילותו נמוכה יותר), והעדר מתילמלוניל-CoA מותאז במטבוליזם של צמחי יבשה ופטריות. עם זאת, צמחי יבשה יכולים לספוג ויטמין B12 מהמצע, והיות שהוויטמין מסיס במים הוא עולה בצינורות העצה לשאר חלקי הצמח. יוצאות דופן מבין הצמחים הן האצות, שכמחצית מהמינים שלהן זקוקים לאספקה חיצונית של ויטמין B12, בשל מחסור באנזים MetE.י(4)

ד. עיכול וספיגה של ויטמין B12

ויטמין B12 נצרך מהמזון כשהוא קשור לחלבונים. תאי האפיתל של הקיבה מפרישים חומצה הידרוכלורית ופפסין, שמנתקים את הקובלמין מחלבוני המזון ומאפשרים את היקשרותו לחלבון ההובלה R, שמופרש ברוק בזמן האכילה. תאי דופן הקיבה מייצרים את הגליקופרוטאין IF (Intrinsic Factor), שלו ספציפיות גבוהה לקובלמין והוא נקשר אליו לאחר ניתוקו מחלבון R בתריסריון באמצעות האנזים טריפסין. הקומפלקס IF-קובלמין נספג דרך תאי דופן המעי, שם חלבון IF מתפרק ומשחרר את הקובלמין לדם. חלבוני הובלה שונים בדם מעבירים את הקובלמין לקולטנים בכל תאי הגוף. עודפי קובלמין מאוחסנים בכבד. על פי הערכות, יכולת הספיגה באופן זה מוגבלת ל-1.5-2µg לארוחה, כי הקולטנים בתאי דופן הקיבה מגיעים לרוויה מקסימלית של ספיגת קובלמין, וזו יכולה לקטון משמעותית בשל גורמים בריאותיים שונים. בנוסף לתהליך הספיגה האקטיבי, כ-1% מהקובלמין נספג בדיפוזיה פסיבית דרך רירית המעי.(3)

2. מחסור בוויטמין B12 – גורמים וסכנות

א. גורמים למחסור בוויטמין B12

על פי הערכות, לכ-40% מהאוכלוסייה יש רמה נמוכה עד גבולית של ויטמין B12. מעל גיל 60, 15%-10% מהאנשים סובלים מבעיות בריאותיות שקשורות למחסור בוויטמין B12. הגורם העיקרי למחסור הוא בעיות בספיגת הוויטמין מהמזון, שנגרמות בשל סיבות כגון: (6,5)

• דלקת רפידת הקיבה (גסטריטיס), שגורמת להפרשה נמוכה של פפסין שתפקידו להפריד את הוויטמין B12 מחלבוני המזון. הפגיעה בקיבה עשויה להיגרם מאורח חיים לקוי כמו עישון וצריכת אלכוהול, וכן מזיהום של החיידק הליקובקטר פילורי, הנפוץ מאוד במבוגרים.

• תת-חומציות בקיבה (היפוכלורידריה) שנגרמת מגסטריטיס מאפשרת שגשוג של מושבות חיידקים בקיבה ובמעי שמנצלים ויטמין B12 כמו אי-קולי, וכך מונעים את המעבר שלו לתאי דופן המעי.

• אנמיה ממארת – מחלה אוטואימונית שגורמת לפגיעה בתאי דופן הקיבה ובחלבוני IF, וכן להפרשת נוגדנים שמתחרים על אתר הקישור של ויטמין B12 לחלבון IF.

• מחלות כרוניות של מערכת העיכול שפוגעות בספיגה הוויטמינים במעיים כמו צליאק, קרוהן, דלקת לבלב כרונית, עמילואידוזיס, סקלרודרמה, לימפומה של המעי.

• שימוש בתרופות נגד צרבת ורפלוקס כמו מעכבי משאבות פרוטונים וחוסמי H2; תרופות לסוכרת כמו מטפורמין; משככי כאבים כמו קולכיצין; תרופות להורדת כולסטרול כמו כולסטיראמין; תרופות לאפילפסיה; סוגי אנטיביוטיקה שונים וגז צחוק.

• ניתוחים בריאטריים (קיצור קיבה) או כריתה של חלק מהמעי.

• פגיעה בדופן המעי בגלל טיפולי הקרנות במחלת הסרטן.

• הידבקות בטפילי מעיים כמו שרשורים כתוצאה מאכילת דגים לא מבושלים.

• בעייה גנטית שגורמת לייצור לא מספק של חלבוני ההובלה.

גורם עיקרי נוסף למחסור בוויטמין B12 הוא צריכה לא מספקת. מקובל לחשוב שצריכת מזון מן החי עונה על דרישות הגוף לוויטמין, אך סקר תזונתי שבוצע בארה"ב על 186,916 נשים וגברים בגילאים 62-56 מקבוצות אתניות שונות הראה שאצל כל אחת ואחת מהקבוצות, המזון שסיפק את השיעור הגבוה ביותר של ויטמין B12 היה דגני בוקר מועשרים, עד 25.5% מסך הצריכה היומית, ודגני בוקר אף סיפקו את הצריכה הגבוהה ביותר של ברזל ואבץ.(7) בניסוי שבדק קבוצה שצרכה מדי יום דגני בוקר עם תוספת B12, מול קבוצה שצרכה דגני בוקר ללא תוספת, הראה שלאחר 14 שבועות, לקבוצה הראשונה הייתה כמות גבוהה ב-20% של ויטמין B12 בדם ורמה נמוכה ב-10% של הומוציסטאין.(8) מכאן שאנשים שנמנעים ממזונות מועשרים כמו דגני בוקר עשויים להיות בסיכון למחסור. בנוסף, נשים בעת היריון או הנקה זקוקות לכמות גדולה יותר של ויטמין B12.

ב. מחלות שקשורות לחוסר בוויטמין B12

תסמינים שונים של מחסור יופיעו בדרך כלל כשהרמה המינימלית בדם של ויטמין B12 בדם נמוכה מ-180pmol/L, אף שתסמינים נצפו גם ברמה גבוהה מכך, ויש חוקרים הטוענים שיש לקבוע את הרמה המינימלית על 300pmol/L. המחלות הנפוצות בשל מחסור בוויטמין B12 הן: (5)(6)

• אנמיה מגלובלסטית – בשל מחסור בוויטמין B12 יש ליקוי בתפקוד מתיונין סינתאז שמוביל לפגיעה בסינתזה התקינה של הדנ"א, בעיקר בתאים שמתחלקים במהירות כמו במח העצם. כתוצאה מכך נוצרים תאי דם אדומים גדולים מהרגיל, כי אינם מצליחים לעבור משלב הגדילה G2 לשלב המיטוזה, וכך תהיה כמות מועטה מדי של תאי דם אדומים, ועל כן נפגמת הובלת החמצן לתאי הגוף. תסמינים: חולשה, עייפות, כאבי ראש, קוצר נשימה, פלפיטציות, התעלפויות.

• פגיעה במערכת העצבים המרכזית – בשל מחסור בוויטמין B12 יש ליקוי בתפקוד מתילמלוניל-CoA מותאז שמוביל לפגיעה במעטפות המיאלין של הנוירונים ובמעבר אותות עצביים. הפגיעה מובילה לתסמינים נוירולוגיים כמו נמלול, אטקסיה, אי-שליטה בסוגרים, פגיעה ברפלקסים, ניוון מקולרי, תתרנות ואין-אונות. במקרים חמורים יופיעו תסמינים נוירופסיכיאטריים כמו אובדן ריכוז, אובדן זיכרון, דיכאון, הזיות, דמנציה ואפילו פסיכוזה.

• מחלות לב ושבץ מוחי – בשל הליקוי בתפקוד מתיונין סינתאז שממיר הומוציסטאין למתיונין, יש הצטברות של הומוציסטאין בפלסמה. ריכוז גבוה של הומוציסטאין הוא אחד מגורמי הסיכון למחלות לב ושבץ מוחי.

• בעיות עיכול – כאב בלשון, אפטות, אובדן תאבון, נפיחות, עצירות ושלשולים.

3. מדוע נפוץ מחסור בוויטמין B12

הצריכה היומית המומלצת של ויטמין B12 היא 2.4-3.0µg. כאמור, מקובל לחשוב שרק אנשים שנמנעים מצריכת מזון מן החי ותוספי תזונה לא יגיעו לצריכה מספקת של הוויטמין, אך יש גורמים רבים שעשויים להקטין במידה רבה את הצריכה.

א. כמויות נמוכות במזון מן החי

• בשר – היות שהמקור היחידי לוויטמין B12 הוא חיידקי, גם בעלי החיים במשקים חייבים לקבל אספקה סדירה. רוב בעלי החיים מקבלים ויטמין B12 כתוסף, בין אם כתוסף מלאכותי, או באמצעות תוספת של קמח בשר או צואת פרות למזון. בעלי חיים שלא יקבלו די ויטמין B12 יסבלו ממחלות חסר שונות. לדוגמה, מחסור בוויטמין B12 בתרנגולות גורם לבצקת, דימומים, התקצרות עצמות, התקצרות מקור, ניוון רגליים, רובד שומני סביב הכבד, הלב והכליות. הביצים שיוטלו יהיו קטנות יותר. אפרוחים שבוקעים עם מחסור יסבלו משיעורי הישרדות נמוכים, עיכוב גדילה, צמיחת נוצות לקויה ובלוטת תריס מוגדלת.(9)

יוצאי דופן הם בעלי חיים מעלי גירה, שלרוב אינם מקבלים תוסף ישיר של ויטמין B12, אלא תוסף של מלחי קובלט במזונם. בשל אוכלוסיית המעיים הגדולה של מעלי גירה, בהינתן מערכת עיכול בריאה ואספקת קובלט נאותה, בעל החיים יוכל לקבל די והותר ויטמין B12 מתוצרת חיידקי המעיים שלו.

מכאן שתכולת ויטמין B12 בבשר תלויה בראש ובראשונה במין בעל החיים ובאופן הגידול שלו, כאשר גידול אינטנסיבי שלא שם דגש על רווחת בעל החיים ישפיע לרעה על תכולת הוויטמינים, ובעלי חיים שנשחטו בגיל צעיר יצברו פחות ויטמין B12 ברקמות. בנוסף, רוב הוויטמין מתרכז בכבד ובכליות, ובחלקי גוף אחרים הכמות תהיה הרבה יותר קטנה, כשהכמות הקטנה ביותר תהיה בחלקי גוף בעלי תכולת שומן גבוהה.(10)

דוגמה להבדלים הרבים בתכולת ויטמין B12 בבעלי חיים שונים ובחלקים שונים מופיעה בטבלה הבאה, שמרכזת מספר מחקרים בנושא.

טבלה 1: הבדלים בתכולת ויטמין B12 בבשר

גם הנתונים הרשמיים של רכיבי מזון שפורסמו על ידי מדינות כמו דנמרק, שוויץ, קנדה וארה"ב מציגים הבדלים משמעותיים בתכולת ויטמין B12 בבשר נא:

בקר – 0.7-5.2µg/100g; כבש – 1.2-5.0µg/100g; עגל – 1.0-2.9µg/100g; חזיר – 0.4-2.0µg/100g; עוף – 0.2-0.6µg/100g.

• מוצרי חלב – גם במוצרי חלב נמצא טווח רחב של ויטמין B12, הן בנתונים הרשמיים של מדינות שונות והן במחקרים שונים: (10)

חלב בקר – 0.08-0.49µg/100g; חלב עזים – 0.07-0.1µg/100g; גבינה – 0.34-3.34µg/100g; יוגורט – 0.12-0.6µg/100g; שמנת – 0.17-0.5µg/100g.

טבלה 2: הבדלים בתכולת ויטמין B12 במוצרי חלב

• ביצים – ביצים הן כנראה המקור הדל ביותר מן החי של ויטמין B12. לתרנגולות יכולת אחסון נמוכה של ויטמין B12, ומחסור יקטין את התכולה בביצה במהירות. ללא תיסוף נאות, הכמות בחלמון הביצה, שבו מתרכז הוויטמין, עשוי להיות לא יותר מ-0.4µg/100g, וגם בתיסוף נאות הכמות תהיה 1.1-1.4µg/100g, ומאחר שחלמון ממוצע שוקל 15 גרם בלבד, הכמות בביצה אחת נמוכה מאוד.(9)

בנוסף, נראה כי הזמינות הביולוגית של ויטמין B12 מביצים נמוכה מאוד, ואינה עולה על אחוזים בודדים:(10)

טבלה 3: זמינות ביולוגית של ויטמין B12

ביצים כנראה מעכבות ספיגת ויטמין B12, כנראה מאותה סיבה שהן מעכבות ספיגת ברזל וביוטין.(11)

• פירות ים – בעבר נחשבו פירות ים, כמו צדפות, מולים ושבלולי ים למקור טוב לוויטמין B12, אך נראה שהבדיקות נעשו בשיטות מיושנות. בדיקת כרומטוגרפיה מתקדמת (LC/ESI-MS/MS) הראתה שהתרכובות העיקריות הן פסבדו-ויטמין B12, שאינו זמין ביולוגית לבני אדם.(12) פסבדו-ויטמין לא רק שאינו יכול לשמש כקו-אנזים כי הפראוקסיזום לא יכול להמיר אותו, הוא גם עלול להיקשר לחלבוני ההובלה ולמנוע היקשרות של ויטמין B12 פעיל, וכך להפחית את הצריכה בפועל.(3) מחקר בחולדות הראה שצריכת סוגים שונים של אנלוגים לוויטמין B12 הפחיתה את פעילות מתילמלוניל-CoA מותאז ב-35% ואת פעילות מתיונין סינתאז ב-80%.(13)

ב. צורות שונות של עיבוד ובישול פוגעות בוויטמין B12

הידרוקסיקובלמין, הצורה הנפוצה ביותר של ויטמין B12 במזון, רגישה מאוד לחום, ובכל צורות הבישול מתקבלים תוצרי פירוק של הידרוקסיקובלמין. לדוגמה, כמות הוויטמין בדגים פחתה עד 62% לאחר צלייה, אידוי, טיגון, בישול במים או בישול במיקרוגל, כשרק בישול בוואקום גרם להפחתה מינימלית. בנוסף, היות שוויטמין B12 מסיס במים, חלק ממנו יעבור למי הבישול.(2)

תרשים 6: פירוק ויטמין B12 בתהליך הבישול

הפגיעה החמורה מתרחשת כנראה בבישול במיקרוגל. חימום של 6 דקות במיקרוגל של בקר נא, חזיר נא וחלב מפוסטר הביא להפחתה שוות ערך ל-30 דקות חימום בסיר של ויטמין B12.

טבלה 4: השפעת חימום במיקרוגל על ויטמין B12

בנוסף, בדיקת תרכובת הקובלמין שנוצרה על חולדות הביאה להבדל שלילי במשקל של עד 70% מול חולדות שקיבלו קובלמין תקני, כנראה כראיה שהבישול במיקרוגל ממיר את הקובלמין לתרכובת שאין לה פעילות ביולוגית ביונקים.(14)

בשורה התחתונה, ייתכן שמנה אחת של בשר מבושל (120 גרם) מספקת רק 5% מהצריכה היומית המומלצת.(10)

מוצרי חלב רגישים במיוחד לשיטות עיבוד שונות.(15,10,2) פסטור חלב גרם להפחתה של 10% בוויטמין B12. פסטור-על להפחתה של עד 20%. הרתחת חלב למשך 5-2 דקות להפחתה של 30%, והרתחה למשך 30 דקות להפחתה של 50%. בחלב עמיד שאוחסן בטמפרטורת החדר נצפתה הפחתה של 33%. אפילו חשיפה לאור במשך 24 שעות גרמה להפחתה של עד 27%.

חיידקים שמתסיסים יוגורט צורכים ויטמין B12 לגדילה, וגרמו להפחתה של 25%. אחסון היוגורט בקירור למשך 14 יום גרם להפחתה נוספת של 33%. סך הכול רק כ-40% מהכמות המקורית של ויטמין B12 שהייתה בחלב נותרה ביוגורט. הפחתה נצפתה גם במוצרי חלב מותססים אחרים.

טבלה 5: הפחתת כמות ויטמין B12 בהכנת מוצרי חלב מותססים

בהכנת גבינות מוסר החלק הנוזלי של החלב (מי-גבינה – Whey) וחלק גדול מהוויטמין המסיס במים אובד אתו. במהלך הכנת גבינת קוטג', נותרו רק 16% מהוויטמין שהיה בחלב המקורי. בהכנת גבינות קשות וגבינות עובש אובדים 60%-43% מהוויטמין המקורי בחלב. יישון הגבינה במשך 32 שבועות גורם לאובדן של עד 10% נוספים.

טבלה 6: הפחתת כמות ויטמין B12 בהכנת גבינות

ג. תוספי תזונה

הדרך היעילה ביותר לשפר מחסור בוויטמין B12 באמצעות תוסף היא בזריקות, וכן בטבליות של הוויטמין המבודד לנטילה מתחת ללשון. עם זאת, הצורה הנפוצה ביותר לצריכה היא בטבליות מולטי-ויטמין הניטלות בבליעה, ובאופן זה, שיעור הספיגה של הוויטמין נמוך מאוד אפילו באנשים בריאים, כשאצל הסובלים מבעיות ספיגה השיעור עשוי להיות בלתי מספק.(16)

טבלה 7: שיעור הספיגה של ויטמין B12 מתוספי תזונה

מלבד זאת, טבליות מולטי-ויטמין מכילות ויטמינים ומינרלים נוספים. נראה כי ויטמין B12 מומר לאנלוגים בלתי פעילים בנוכחות ויטמין C ונחושת, ככל הנראה בגלל שוויטמין C מייצר רדיקלים בנוכחות נחושת. במחקר נצפתה הפחתה של 70% בגדילת מיקרואורגניזמים שמנצלים ויטמין B12, אם כי נוכחות נוגדי החמצון קרנוזין ואנסרין שקיימים באופן טבעי במזון מנעה במידה רבה את הפגיעה בוויטמין B12.י(17)

תרשים 7: הפגיעה בפעילות ויטמין B12 בנוכחות ויטמין C ונחושת

קיימים גם תוספי תזונה "טבעיים" כמו ספירולינה, שנחשבת לאצה אך למעשה אינה חלק מממלכת הצמחים אלא מיקרואורגניזם פרוקריוטי שמבצע פוטוסינתזה. טענת היצרנים שספירולינה מכילה כמויות נכבדות של ויטמין B12 מסתמכת כנראה על בדיקה שאינה מפרידה בין אנלוגים שונים של הוויטמין, היות שנמצאו הבדלים גדולים מאוד כאשר מוצרים שונים נבדקו בשיטה שמפרידה בין אנלוגים. מכאן שחלק הארי של קובלמין בטבליות ספירולינה הוא אנלוגים לוויטמין B12, והנזק בצריכתן עולה על התועלת.(18)

טבלה 8: הבדלים גדולים של נוכחות ויטמין B12 במוצרי ספירולינה

לאור הנתונים לעיל, יש חשיבות רבה בהגדלת המקורות הצמחיים של ויטמין B12.

4. סקירת המקורות הצמחיים לוויטמין B12

א. מזונות מותססים

כאמור, חיידקים הם המקור היחיד לוויטמין B12, וחיידקים גם מאפשרים את ייצורם של מזונות כבושים ומותססים, שנפוצים בתרבויות רבות, ולכן עשויים לסייע בהגדלת הצריכה של ויטמין B12. מחקרים שונים הראו כי תהליך ההתססה מעודד ייצור ויטמין B12 במזונות המותססים, לדוגמה:

• יוגורט סויה – ליוגורט הוסיפו חיידק Lactobacillus reuteri שיכול לשכון במעיים של האדם ומייצר קורינואידים בעלי פעילות ביולוגית שהוכחו שמונעים מחלות חסר בוויטמין B12 בחולדות. ליוגורט הוספו כמויות שונות של גלוקוז, גליצרול ופרוקטוז כתזונה לחיידקים עבור ההתססה ונבדקו כמויות הוויטמין שהופקו. השיעור המוצלח ביותר של ויטמין B12 היה 18µg/100ml.י(19)

טבלה 9: ויטמין B12 ביוגורט סויה

• טמפה – טמפה הוא מוצר סויה מותסס שמקורו באינדונזיה. פולי הסויה מושרים, מבושלים ומיובשים, ולאחר מכן מותססים עם פטריית ריזופוס, שמונעת גדילת פטריות אחרות, והחיידקים שמשתתפים בהתססה מייצרים ויטמין B12. במוצר המוגמר נמצא 0.7-8µg/100g ויטמין B12, כאשר העלייה הרבה בתכולת הוויטמין התרחשה במהלך האחסון. אפילו מזונות מעובדים מטמפה (טמפה-בורגר) שנמכרים בארה"ב הכילו 0.06-0.12µg/100g ויטמין B12.י(20)

טבלה 10: תכולת ויטמינים לפני ואחרי התססת טמפה

• תה שחור מותסס – סוגים שונים של תה עוברים התססה במהלך הייצור שלהם, והפעילות החיידקית עשויה להגדיל את כמות ויטמין B12. בתה שחור יפני מסוג batabata-cha נמצא 0.456µg/100g ויטמין B12 בעלים יבשים. חרף הכמות הנמוכה, במחקר על חולדות עם מחסור בוויטמין B12, נמצא שיפור גדול יותר במדדים בקבוצה שקיבלה תמצית תה שחור מול הקבוצה שקיבלה תוסף ציאנוקובלמין. מכאן שהקובלמין בתה השחור זמין ביולוגית ליונקים וגם אינו קשור ולכן נספג בקלות רבה יותר מהתוסף המלאכותי.(21)

• ירקות מוחמצים – החיידק פרופיוניבקטריום (propionibacteria) משמש בתעשייה לייצור ויטמין B12 מלאכותי. במחקר נבדקה ההשפעה של הוספת החיידק לירקות במהלך התססה, היות שהחיידק גם מעכב התפתחות חיידקים, קוליפורמים ופטריות שמקלקלים את המוצר. התססת כרוב חמוץ עם החיידק במשך 64 יום הניבה 72.1µg/kg ויטמין B12. עם זאת, גם בהתססה טבעית ללא החיידק התקבלה כמות נאה של 20.1µg/kg ויטמין B12, ואפילו כרוב חמוץ תעשייתי הכיל 1.3µg/kg ויטמין B12. התססת מיץ סלק אדום עם זנים שונים של החיידק במשך 14 יום הניבה עד 22.58µg/L ויטמין B12.י(22) בניסוי אחר, כבישת עלי חילבה ללא החיידק פרופיוניבקטריום הניבה 12.5µg/100ml ויטמין B12י.(23)י

• מוצרים מותססים מהמטבח הקוריאני – מחקר על קוריאנים בני 100 ויותר, שתזונתם מבוססת בעיקר על צמחים, גילה כמה מקורות לוויטמין B12 בתזונה המסורתית שלהם, והנחקרים לא סבלו מהמחסור שנפוץ בקרב מבוגרים בתרבויות אחרות. התגלה ויטמין B12 בכמות גבוהה במוצרים ביתיים ובכמות נמוכה יותר במוצרים תעשייתים כגון ממרח סויה קוריאני (Doenjang), פולי סויה מותססים (Chungkookjang), רוטב סויה קוריאני וקימצ'י (Kimchi) שעשוי כרוב או עלי חרדל מותססים.(24)

טבלה 11: ויטמין B12 במזונות מהמטבח הקוריאני

ב. אצות

אצות הן כיום המזון הצמחי בעל הריכוז הגבוה ביותר של ויטמין B12 שנבדק במחקרים רבים והוכח כפעיל ביולוגית בבני אדם. אצות מסוימות אף הכילו ריכוז גבוה יותר מבכבד בקר. כאמור, כמחצית ממיני האצות זקוקים לאספקה חיצונית של ויטמין B12, והאצות צוברות את הוויטמין כתוצאה מסימביוזה עם חיידקים: פחמן בתמורה לקובלמין.(25) המחקר הראשון שמצא ויטמין B12 באצות נערך כבר ב-1953,(26) ומאז נערכו עוד מחקרים רבים, לדוגמה:

• בדיקת תכולת ויטמין B12 בשבעה סוגי אצות מאכל:

Raw asakusanori (Porphyra tenera), raw maruba-amanori (Porphyra suborbiculata), raw funori (Gloiopeltis tenax), raw akaba-gin-nansou (Rhodoglossum pulcherum), dried kombu (Laminaria angustata), wakame (Undaria pinnatifida), dried hijiki (Hijikia fusiforme)

התוצאות הראו נוכחות ויטמין B12 בכל אחד מסוגי האצות.(27)

טבלה 12: ויטמין B12 באצות שונות

• בדיקת תכולת ויטמין B12 בשני סוגים של אצות נורי:

Green laver (enteromorpha sp.), Purple laver (porphyra sp.)

תכולת הוויטמין נבדקה גם בשיטה שמפרידה אנלוגים וגם בשיטה שאינה מפרידה, וההבדל בתוצאות לא היה משמעותי מבחינה סטטיסטית, מכאן שהאצות אכן מכילות ויטמין B12 אמיתי ולא אנלוגים.

טבלה 13: ויטמין B12 בשני סוגי אצות נורי

באצה מסוג Green laver התגלה בממוצע  69.2µg/100g ויטמין B12, מכאן שדי ב-3-2 דפי נורי ביום לאספקת הצריכה המומלצת. בנוסף הוכח שחולדות עם מחסור סופגות את הוויטמין מאצות. לאחר 20 יום של אכילת אצות פחתה לאפס הפרשת החומצה המתיל-מלונית (שמופרשת בגלל פגיעה באנזים מתילמלוניל-CoA מותאז) בחולדות ורמת הוויטמין בדם גדלה משמעותית. החוקרים אף התבססו על מחקר קודם שמצא באצות וואקמה 0.6µg/100g ויטמין B12 ובאצות קלפ 0.1µg/100g.י(28)

• באותו מחקר על קוריאנים בני 100 ויותר, התגלה כי גם סוגים שונים של אצות (נורי, חסת ים, קלפ [Sea tangle], וואקמה [Sea mustard]) תורמים לאספקת ויטמין B12.י(24)

טבלה 14: ויטמין B12 באצות שונות

• באצת נורי מסוג Purple laver (porphyra yezoensis) נמצא 49±1.51µg/100g ויטמין B12, כשהצורה הדומיננטית (65%) הייתה של הקו-אנזים מתילקובלמין.(29)

• באצת נורי מסוג Purple laver (porphyra sp.) מזן קוריאני נמצא לפני קלייה 133.8µg/100g ויטמין B12 ולאחר קלייה 51.7±15.2µg/100g ויטמין B12. החוקרים התבססו גם על מחקרים אחרים שבהם נמצא באצות מסוג Iwa-nori 86.5µg/100g ו-120.7µg/100g ויטמין B12.י(30)

• באצת נורי מסוג Purple laver (porphyra yezoensis) נמצא 58.6µg/100g ויטמין B12י, 60% בצורת קו-אנזים אדנוזיל/מתילקובלמין, והשאר בצורות פעילות אחרות ציאנו/הידרוקסיקובלמין. ייתכן שהשינויים בתכולת הוויטמין באצות שונות נובעים משוני בזנים או בתנאי הגידול, או שבאזורי גידול שונים של האצות יש ריכוזים שונים של הוויטמין. חולדות עם מחסור בוויטמין B12 קיבלו במשך 9 שבועות תוספת של אצה למזון בהיקף של 10µg/kg מזון. קבוצת הביקורת קיבלה תוסף ציאנוקובלמין. החולדות שקיבלו תוספת אצות עלו במשקל בצורה טובה יותר והפרשת חומצת מתיל-מלונית פחתה לאפס. כמות הוויטמין בכבד עלתה מ-73.8 ל-158.2µg/kg רקמת כבד.(31)

• בשלושה מותגים של אצות מסוג כלורלה שמשווקות כתוסף תזונה (ובניגוד לספירולינה זו אצה אמיתית) נמצאה כמות גבוהה מאוד של ויטמין B12, כאשר הבדיקה שמבדילה בין אנלוגים הראתה שהרוב המכריע של החומרים שהתגלו הם ויטמין B12 אמיתי.(32)

טבלה 15: ויטמין B12 בטבליות כלורלה

ג. פטריות

מחקרים מעטים ומבטיחים נערכו על נוכחות ויטמין B12 בפטריות. בבדיקת שישה מיני פטריות שנפוצות בשוק האירופי, Porcini (Boletus spp.), Parasol (macrolepiota procera), Oyster (pleurtus ostreatus), Black morels (morchella conica), Black trumpets (craterellus cornucopioides), Golden chanterelles (cantharellus cibarius), התגלה בכל אחד ממיני הפטריות כמויות שונות של ויטמין B12, שהוכח בכרומטוגרפיה כוויטמין אמיתי ולא פסבדו-ויטמין.(33)

טבלה 16: ויטמין B12 בפטריות שונות

ה-Alkali-resistanat factor שמופיע בטבלה והוחסר מהתוצאות הוא קו-אנזים מסוג שונה ואינו פסבדו-ויטמין, ואף שאינו משמש כוויטמין B12 אמיתי, אין נזק בצריכתו.

במחקר נוסף על פטריות בר (Lactarius laeticolorus, Suillus spectabilis, Ramaria botrytis, Cortinarius pseudosalor, Boletopsis leucomelas, Sarcodon aspratus) ופטריות מגידול מסחרי (Pleurotus eryngii, Grifola frondosa, Hypsizygus marmoreus), נמצא בממוצע 1.0µg/100g ויטמין B12. הממצא הגבוה ביותר, עד 12.71µg/100g ויטמין B12, נמצא בזנים שונים של פטריית שיטקי (Lentinula edodes), שנפוצה כיום בכל העולם. גם במחקר זה הוכח שנמצא ויטמין B12 אמיתי ולא פסבדו-ויטמין.

טבלה 17: ויטמין B12 בסוגים שונים של פטריות שיטקי

מעניין לציין שכמות הוויטמין B12 גדלה עם התפתחות גופי הפרי, ובנוסף התגלה שמצע העץ הנרקב שעליו מגדלים את הפטריות (Konara oak) הכיל כמות זהה של ויטמין B12 לאחר הבשלת גופי הפרי, והוכח כוויטמין B12 אמיתי. ייתכן שמקור הוויטמין הוא חיידק pseudomonas sp. שמשתמש בתוצרים שהפטריה מפרקת מהעץ.(34)

טבלה 18: ויטמין B12 בעץ הנרקב

ד. מזון אורגני עם דשן עשיר

מחקרים ראשוניים שצמחים יכולים לספוג ויטמין B12 ולאגור אותו הראו כמויות קטנות של הוויטמין בצמחים שגדלו על זבל אורגני כמו כרוב, תרד, חרצית עטורה, פקעת שושן, טארו, ברוקולי, אספרגוס, Japanese butterbur, נבטי שעועית מש, מלוכיה, water shield.י(35) גם בתה ירוק אורגני שלא עבר התססה נמצאה כמות קטנה של 0.22µg/100g ויטמין B12.י(36)

במחקר על 6 ילדים טבעונים בגילאים 14-7 שחיים על תזונה טבעונית 10-4 שנים שכוללת אורז חום ו-4-2 גרם נורי ביום, לא היו כל תסמיני מחסור בוויטמין B12 או הבדל סטטיסטי מול קבוצת הביקורת. כל המזון היה מגידול מקומי אורגני. החוקרים סוברים שמלבד צריכת מזון אורגני ואצות נורי, ניתן לזקוף את הרמה התקינה של ויטמין B12 לזכות הלעיסה הקפדנית של המזון שגורמת להפרשת חלבון R מהרוק וכך לאפשר ניצול אופטימלי של הוויטמין, לכך שהירקות נאכלים ללא קילוף וכך הוויטמין שמסונתז על ידי מיקרואורגניזמים נשאר על הירקות, ואף לצריכת מזונות עשירים בקובלט כמו כוסמת, שעועית אזוקי, שעועית אדומה, שיטקי והיג'יקי שמסייעים לחיידקי המעיים לסנתז ויטמין B12. י(37)

טבלה 19: בדיקות הדם של 6 ילדים טבעונים

מכל מקום, אף על פי שאין כיום בסיס מחקרי רחב דיו לשער כי צריכת מזון אורגני שגודל עם דשן עשיר עשויה לשמש מקור מספק לוויטמין B12, היכולת של הצמחים לספוג את הוויטמין מהאדמה פותחת פתח לספק את הוויטמין באמצעות העשרה יזומה.

5. העשרת גידולים חקלאיים בוויטמין B12 באמצעות הזנה מהשורש

Bito; N. Ohishi; Y. Hatanaka; S. Takenaka; E. Nishihara; Y. Yabuta; F. Watanabe. Production and Characterization of Cyanocobalamin-Enriched Lettuce (Lactuca sativa L.) Grown Using Hydroponics. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3852−3858.

מטרת המחקר

גידול ואפיון עלי חסה מועשרים בוויטמין B12 במערכת הידרופונית.

מבוא

מחקרים ראשוניים הוכיחו את יכולתם של צמחים לספוג ויטמין B12 באמצעות השורשים בהתאם לריכוז המצוי בתמיסת הקרקע ולהעביר את הוויטמין לחלקי צמח אחרים כמו נצרים ועלים דרך מערכת העצה. לדוגמה:

• שתילי סויה שהושרו בריכוזים שונים של ויטמין B12 במשך 24 שעות ספגו את הוויטמין באופן ליניארי לריכוז וזה החל להופיע בעלים תוך 30 דקות בלבד.

34.5%-13.5% מהוויטמין הגיע לחלקי הצמח שאינם שורשים. בנוסף, נראה שיש אף מעבר מסוים של ויטמין B12 מהעלים לחלקי הצמח האחרים דרך מערכת השיפה.(38)

טבלה 20: צבירת ויטמין B12 בחלקי הצמח השונים כתלות בריכוז בתמיסת הקרקע

• אדמה שהועשרה בצואת פרות שמכילה באופן טבעי כמויות גדולות של ויטמין B12 או הועשרה בצורה הטהורה של ויטמין B12, הגדילה באופן משמעותי את צבירת הוויטמין בזרעי סויה, זרעי שעורה ועלי תרד.(39)

טבלה 21: ויטמין B12י (ng/g) בצמחים לאחר העשרת הקרקע

• זרעי צנון יפני הושרו בריכוזים שונים של ויטמין B12, ולאחר 6 ימי גידול התגלתה כמות משמעותית של ויטמין B12 בנצרים.(40)

טבלה 22: ויטמין B12 בצנון יפני לאחר השריית הזרעים בריכוזים ובזמנים שונים

במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחסה (Lactuca Sativa), שהיא ירק עלים חד-שנתי, נפוץ וקל לגידול, שמשמש בכל העולם בסלטים וכריכים ומהווה מקור טוב לוויטמינים ומינרלים. הגידול נעשה בטכנולוגיה הידרופונית שמאפשרת שליטה טובה יותר באספקת המים והמינרלים ועל כן עלתה הסברה שבתנאי הגידול ההידרופוניים ניתן יהיה לשלב ויטמין B12 בעלי החסה.

מהלך המחקר

זרעי חסה נשתלו באדמה חולית וגודלו במשך 24 יום. לאחר מכן הועברו השתילים לעציצים הידרופוניים למשך 30 יום. 24 שעות לפני הקטיף נוסף לתמיסה ציאנוקובלמין בריכוזים שונים: 0,י 1, י5,י 10µmol/L.

לאחר מיצוי נבדקה כמות ויטמין B12 בעלים באמצעות החיידק Lactobacillus delbrueckii תלוי-קובלמין. זיהוי הצורות השונות של קובלמין נעשה באמצעות חיידק Escherichia coli 215 תלוי-קובלמין לאחר הפרדה בג'ל סיליקה עם או ללא מיצוי ב-KCN שממיר תרכובות קובלמין שונות עם ליגנד עליון אחר לציאנוקובלמין. לאחר טיהור נוסף בקולונה אימונואפינית בוצעה אנליזה בכרומטוגרפיה מתקדמת (LC/ESI-MS/MS).

תוצאות

ריכוז הקובלמין בעלי החסה עלה במידה משמעותית עם ריכוזי ציאנוקבולמין של עד 5µmol/L. אף על פי שחסות לא צריכות קובלמין לגדילה, הן יכולות לספוג ולרכז קובלמין בעלים. מאחר שעלי חסה שטופלו עם 1µmol/L ציאנוקולבמין הכילו 1.3 ± 0.6 μg של קובלמין למנת חסה טרייה, צריכת שתי מנות תספק את הצריכה היומית המומלצת של קובלמין למבוגרים. עלי חסה שטופלו עם 5µmol/L ציאנוקולבמין הכילו 6.8 ± 3.4 μg של קובלמין למנת חסה טרייה, לכן די יהיה בצריכת שניים-שלושה עלים לקבלת הצריכה היומית המומלצת.

טבלה 23: ויטמין B12 בעלי חסה שטופלו בריכוזים שונים

הנתונים מראים שחסות סופגות 0.03% בלבד מהציאנוקובלמין בריכוזי 1, 5µmol/L, ורק 0.02% בריכוז 10µmol/L. מכאן שבמהלך הגידול ההידרופני ניתן להשתמש בתמיסה שימוש חוזר.

הבדיקה באמצעות חיידק Escherichia coli 215 תלוי-קובלמין לאחר הפרדה בג'ל סיליקה הראתה שערך Rf של התרכובת שמוצתה עם או ללא KCN מעלי החסה זהה לזה של ציאנוקובלמין מקורי (0.63) ולא לצורות אחרות של קובלמין או של פסבדו-ויטמין.

תרשים 8: ערכי Rf של קובלמין מקורי (A1, B1), פסבדו-קובלמין (A2), מיצוי מעלי החסה עם KCN (A3), מיצוי מעלי החסה ללא KCN (B2)

גם הבדיקה בכרומטוגרפיה הראתה שהפיק היוני וערכי m/z של המיצוי מעלי החסה עם או ללא KCN זהים לאלה של ציאנוקובלמין מקורי.

תרשים 9: כרומטוגרפיה של ציאנוקובלמין מקורי (A-C), מיצוי עלים עם KCN י(D-F), מיצוי עלים ללא KCNי (G-I)

דיון ומסקנות

בגידול מסחרי רגיל מסופק לצמחים בדרך כלל רק דשן אנאורגני שמכיל אך ורק את המינרלים החיוניים להתפתחות הצמח אך חסר חומרים נוספים שנמצאים באופן טבעי בדשן אורגני, שאינם חיוניים לצמח, כמו ויטמין B12. היות שבדיקות מקיפות על נוכחות ויטמינים ומינרלים שונים בצמחים החלו רק לאחר שנעשה נפוץ השימוש בדשן אנאורגני, התבססה ההשערה שבצמחים אין ויטמין B12.

אף על פי כן, למרות שכנראה אין לצמחים כל צורך בוויטמין B12, הם בהחלט יכולים לספוג אותו דרך השורשים בקלות רבה ובמהירות, ולצבור אותו בחלקים אחרים של הצמח. ייתכן אף שנוכחות הוויטמין מסייעת להתפתחות הצמח, אף שאינה חיונית לו, היות שעלי החסה במחקר גדלו במהירות רבה יותר בתוספת קובלמין בתמיסה.

מראיות אלה ניתן להסיק שדישון קרקעות בדשן אורגני או דשן אנאורגני מועשר בוויטמין B12, או לחלופין גידול הידרופני של צמחים בתמיסה מועשרת בוויטמין B12, יסייעו בהגדלת כמות הוויטמין בחלקי הצמח האכילים ובשיפור הצריכה של ויטמין B12 בכל האוכלוסייה. בתנאי המחקר, כדי להעשיר את צמחי החסה בוויטמין B12, התוספת לעלות הגידול תהיה פחות מאגורה לכל ראש חסה.

6. ביוסינתזה של ויטמין B12 בחיידקי קרקע שחיים בסימביוזה עם צמחים

H Takano; K. Hagiwara; K. Ueda. Fundamental role of cobalamin biosynthesis in the developmental growth of Streptomyces coelicolor A3 (2). Appl Microbiol Biotechnol (2015) 99:2329–2337.

מטרת המחקר

יצירת מוטנט לחיידק Streptomyces coelicolor A3 (2)  עם נוקאאוט לגן לביוסינתזה של קובלמין (cob) לבחינת תפקיד ייצור הקובלמין בחיידקים שוכני קרקע שחיים בסימביוזה עם צמחים.

מבוא

סטרפטומיציטים הם מין של חיידקי גראם חיובי יוצרי קורים שוכני קרקע ממערכת האקטינובקטריה, שמתאפיינת בסימביוזה עם צמחים וביצירת תפטיר ונבגים בדומה לפטריות. חשיבותם של החיידקים האלה למערכת האקולוגית גבוהה ביותר – הם מפרקים חומר אורגני, הם מקבעים חנקן עבור צמחים בתמורה לפחמן והם מייצרים מטבוליטים שונים שמסייעים לגדילת אורגניזמים אחרים, ביניהם קובלמין. בתעשייה משמשים חיידקי אקטינובקטריה לא רק לייצור מסחרי של ויטמין B12, אלא גם לייצור אנטיביוטיקות שונות וחומרי כימותרפיה.

קובלמין משמש בפרוקריוטים כקו-אנזים למסלולים מטבוליים שונים, בדומה לתפקידו בבעלי חיים, אך בניגוד לבעלי חיים קיים בחיידקים מסלול ביוכימי לביוסינתזה של קובלמין עם קבוצת גנים בשם cob שמקודדת לאנזימים השונים שדרושים לייצור הוויטמין, לדוגמה, cobN אחראי על הכנסת אטום הקובלט לטבעת הקורין. ההשערה היא שהשתקת הגנים האלה או חלקם תפגע בביוסינתזה של קובלמין ותשפיע לרעה על החיידק. הגנום של הסטרפטומיציטים כבר רוצף וידוע שהגנים לביוסינתזה של קובלמין נמצאים בכולם ומרוכזים בשלושה לוקוסים. הלוקוס שעליו מתבצע המחקר עם תשעת הגנים שלו מופיע בתרשים הבא.

תרשים 10: תשעת הגנים בקבוצת cob לביוסינתזה של קובלמין

מהלך המחקר

חיידקים ממין Streptomyces coelicolor A3 (2) גודלו ב-28° במצעים שונים: מצע עשיר עם מלטוז או גלוקוז כמקור פחמן, ומצע מינימלי עם מלטוז או גלוקוז. זן הבר נבדק מול חיידקים שבוצע בהם נוקאאוט לשלושת הגנים הראשונים בקבוצת הגנים cob שמכונים cobD, cobQ ו-cobN. הנוקאאוט בוצע באמצעות הכנסת פריימרים ארוכים (אוליגונוקלאוטידים) שמשבשים את מסגרת הקריאה והוספת קסטה של עמידות לאנטיביוטיקה אפרמיצין. וידוא הרקומבינציה בוצע באמצעות PCR. בנוסף הוכנו פלסמידים עם אופרון של הגנים שעברו נוקאאוט כדי לבדוק אם הוספת הפלסמיד למוטנט תשיב את הפעילות.

תוצאות

כמות הקובלמין המיוצרת נבדקה בחיידק המוטנטי במצע עשיר עם מלטוז וזו הייתה אפסית לחלוטין.

תרשים 11: ייצור קובלמין בזן הבר מול המוטנט cob

במצע עשיר לא נצפה שינוי משמעותי בגדילה של המוטנט לעומת זן הבר. במצע מינימלי עם מלטוז גם המוטנט וגם זן הבר התקשו לגדול. במצע מינימלי עם גלוקוז זן הבר גדל היטב אך גדילתו של המוטנט עוכבה.

תרשים 12: שינויים בגדילת החיידק. קו רציף – זן הבר. מקווקו – מוטנט. עיגול – גלוקוז. ריבוע – מלטוז

הוספה חיצונית של קובלמין שיפרה מעט את גדילתו של המוטנט. הוספת הפלסמיד עם האופרון של הגנים החסרים ביטלה את העיכוב בגדילה.

תרשים 13: שינויים בגדילת החיידק עם תוספת קובלמין חיצונית. משמאל: זן הבר, מוטנט, מוטנט עם פלסמיד

במוטנט התרחשה פגיעה בייצור הקרוטנואידים. תאי זן הבר צוברים פיגמנט צהוב באור, אך המוטנט לא צבר את הפיגמנט. תוספת מתילקובלמין למצע או תוספת הפלסמיד השיבו את צבירת הקרוטנואידים.

תרשים 14: צבירת פיגמנט צהוב באור. משמאל: זן הבר, מוטנט, מוטנט עם מתילקובלמין, מוטנט עם פלסמיד

במוטנט התרחשה פגיעה בייצור החומר האנטיביוטי, וכן בייצור התפטיר והנבגים. תוספת קובלמין למצע השיבה את יכולת הייצור.

תרשים 15: התפטיר בזן הבר מול המוטנט במיקרוסקופ אלקטרוני

תרשים 16: ייצור שני סוגי אנטיביוטיקה בזן הבר מול המוטנט

בשל יכולתו לייצר קובלמין, החיידק מבטא בדרך כלל את האנזים מתיונין סינתאז במסלול metH, התלוי-קובלמין, בדומה לבעלי חיים, אך בהעדר קובלמין מבטא המוטנט את המסלול למתיונין סינתאז שאינו תלוי-קובלמין – metE.

תרשים 17: ביטוי metE ו-metH בזן הבר, במוטנט ובמוטנט עם הפלסמיד

דיון ומסקנות

נוקאאוט לגנים לביוסינתזה של קובלמין מנע את ייצור הקובלמין בחיידק והשפיע על הגדילה וההתפתחות של החיידק, כראיה שמגוון תפקודים תלויי קובלמין חיוניים לפיזיולוגיה של החיידק. למרות זאת החיידק המוטנטי המשיך להתקיים ולהתרבות, כלומר גם ללא ייצור קובלמין הוא יכול לספוג קובלמין מהסביבה או לבטא אנזימים חלופיים.

תוספת חיצונית של קובלמין שיפרה מעט את הגדילה, אך עדיין יש עיכוב כנראה בגלל מנגנון ספיגה לא יעיל. תוספת מתיונין לא שיפרה את הגדילה כי כנראה יש תפקוד תלוי קובלמין נוסף שמעוכב מלבד מסלול המתיונין סינתאז. תוספת האופרון עם הגנים החסרים ביטלה את העיכוב בגדילה.

במוטנט cob יש פגיעה בייצור הקרוטנואידים, בייצור הפיגמנט האנטיביוטי ובייצור התפטיר והנבגים. תוספת קובלמין ממקור חיצוני שיקמה את יכולות הייצור. נראה שלנוקאאוט הייתה השפעה פליוטרופית ומכאן שהקובלמין מעורב בגדילה ובהתפתחות, הן בתהליך ששולט בהתמיינות התאים והן בייצור אנטיביוטיקה.

החיידק מבטא metE בסביבה דלת-קובלמין כפיצוי על אובדן פעילות metH. זו כנראה הסיבה שקיומו של החיידק לא היה תלוי באספקה חיצונית של מתיונין, והעיכוב בגדילה נגרם כנראה מפגיעה במסלול תלוי-קובלמין אחר.

היות שביוסינתזה של קובלמין הכרחית לחיידקים ממערכת האקטינובקטריה, והיות שהם חיים בסימביוזה עם צמחים ומייצרים פקעיות בשורשי הצמחים להחלפת חנקן בפחמן, ניתן להסיק שחומרים נוספים עוברים מן החיידקים לצמחים. מחקר על כמה מיני צמחים שחיים בסימביוזה עם חיידקי אקטינובקטריה גילה בהם כמות משמעותית של ויטמין B12. הצמח היפופיאה מצוי (אובליפיחה), הנפוץ ברוסיה, בצפון אירופה ובמרכז אסיה, וגרגריו משמשים למאכל, לבישול ולתרופות עממיות, הכיל 37.01µg/100g ויטמין B12 למשקל יבש. פירוש הדבר ש-6.5 גרם פירות היפופיאה מצוי מיובשים מספקים את הכמות היומית המומלצת של ויטמין B12. כמות גבוהה של ויטמין B12 נמצאה גם באלומית זוחלת שמשמשת כעשב מרעה חשוב (25.83µg/100g) וטיון השמש שמשמש לתרופות עממיות ולמשקאות אלכוהוליים (10.62µg/100g).(41)

טבלה 24: ויטמין B12 בצמחים שונים

אף על פי שרק חלק קטן ממיני הצמחים בעולם חיים באופן טבעי בסמיביוזה עם חיידקי אקטינובקטריה, בשל יכולתם לקבע חנקן משתמשים בהם גם באמצעות הדבקה מלאכותית לצמחי תרבות אחרים במטרה לשפר יבולים. לדוגמה, הדבקת שורשי הדרים במשתלה בחיידקי אקטינובקטריה שיפרה באותו פרק זמן מול הביקורת את גובה השתיל, מספר העלים, קוטר השורש ומשקל הצמח בעשרות אחוזים.(42)

טבלה 25: שיפור היבול בשתילי הדרים שהודבקו בחיידקי אקטינובקטריה

מכאן ניתן להסיק שהדבקה יזומה של צמחי תרבות בחיידקי אקטינובקטריה לא רק תסייע לשיפור היבולים אלא גם תגרום לצמח לצבור ויטמין B12 בתאים לתועלת בני האדם ובעלי החיים שייזונו ממנו.

7. סימביוזה בין אצות לחיידקים: פחמן תמורת ויטמין B12

Kazamia; H. Czesnick; T.T.V. Nguyen; M.T. Croft; E. Sherwood; S. Sasso; S.J. Hodson; M.J. Warren; A.G. Smith. Mutualistic interactions between vitamin B12-dependent algae and heterotrophic bacteria exhibit regulation. Environ Microbiol. 2012 Jun;14(6):1466-76.

מטרת המחקר

בחינה ברמה המולקולרית של הבקרה ההדדית במערכת היחסים הסימביוטית בין אצות שזקוקות לוויטמין B12 לחיידקים שמייצרים את הוויטמין, ובתמורה מקבלים פחמן מהאצות.

מבוא

ויטמין B12 הוא נוטריאנט חיוני לכמחצית ממיני האצות, היות שבדומה לבעלי חיים תאי מיני האצות האלה זקוקים לוויטמין B12 כקו-אנזים למתיונין סינתאז תלוי-קובלמין (metH), בעוד מיני אצות אחרים משתמשים במתיונין סינתאז שאינו תלוי-קובלמין (metE), בדומה לצמחים ופטריות, אף על פי שיעילותו נמוכה יותר. מבחינה אבולוציונית, נראה שאובדן הגן metE אירע באופן נפרד במיני אצות שונים, כאשר סביבה עשירה בקובלמין אפשרה למוטציות לא-לטליות בגן metE להשתרש באוכלוסיה, היות שהסביבה העשירה בקובלמין העניקה עדיפות לביטוי הגן metH. הדבר דומה לאובדן היכולת לייצור ויטמין C בבעלי חיים שסביבתם האבולוציוניות הייתה עשירה בפירות, כמו עטלפי פרי ופרימטים, וביניהם האדם. רוב בעלי החיים יכולים לייצר ויטמין C, אך מוטציות לא-לטליות בגן השתרשו במיני בעלי חיים שסביבתם סיפקה מקור עשיר לוויטמין C.

נראה שמי הים אינם המקור העיקרי לוויטמין B12 באצות, היות שלגידול בתרבית של רוב מיני האצות נדרש 7pM (10ng/L) ויטמין B12, ואילו ריכוז הוויטמין במי ים הוא 0-3pM, על כן פרוקריוטים מייצרי ויטמין B12 הם כנראה המקור העיקרי. במחקרים קודמים התגלו מערכות יחסים סימביוטית בין מיני אצות שונים ומיני חיידקים שונים, כשהדבקה יזומה של האצות האיצה במידה רבה את גדילתן.

מהלך המחקר

נבדקו שני מיני אצות: Chlamydomonas nivalis, שמשתמשת רק במסלול metH ולכן חייבת אספקה חיצונית של ויטמין B12, ו-Chlamydomonas reinhardtii, שמשתמשת הן ב-metH והן ב-metE. היות ש-Chlamydomonas nivalis גדלה בתרבית ללא תוספת של ויטמין B12, התאים החיידקיים שנמצאו בתרבית נבדקו ב-PCR ורוצפו. לאחר מכן הוספה אנטיביוטיקה לתרבית כדי לבדוק מה השפעת נוכחות החיידקים על האצה.

האצה Lobomonas rostrata שתלויה בקובלמין נבדקה בתרבית עם שלושה מיני חיידקים: Mesorhizobium loti , Rhizobium leguminosarum ו-Sinorhizobium meliloti. התרבית לא כללה אספקת ויטמין B12 לאצה ולא אספקת פחמן לחיידקים.

כדי לבדוק האם יש צורך במגע ישיר בין האורגניזמים הוכנסה לתוך צלוחית אגר עם תאי אצה מבחנה עם תאי חיידקים שבה נקבים המאפשרים מעבר נוטריאנטים אך לא מעבר תאים, ובנוסף נבדקה גדילתם של תאי האצה במרחקים שונים מתאי החיידק.

תוצאות

ריצוף גנום החיידק שנמצא בתרבית האצה  Chlamydomonas nivalis גילה דמיון רב לחיידק Mesorhizobium loti, שמצוי בקרקע וחי בסימביוזה עם צמחים, וידוע ביכולתו לייצר ויטמין B12. לתוספת אנטיביוטיקה לתרבית האצה שקיבלה אספקה חיצונית של ויטמין B12 לא הייתה כל השפעה, אך תוספת אנטיביוטיקה לתרבית האצה שלא קיבלה אספקה חיצונית גרמה לתאי האצה למות במהרה.

בדיקת תרבית האצה Lobomonas rostrata עם שלושה מיני חיידקים הראתה שאף אחד מהאורגניזמים לא יכול להתפתח בבידוד. תרבית משותפת של האצה עם כל אחד ממיני החיידקים הראתה שהחיידקים מסייעים לגדילת האצה, כשהחיידק Mesorhizobium loti היה המוצלח ביותר.

תרשים 18: שיעור גדילת האצה Lobomonas rostrata בתרבית עם שלושה מיני חיידקים שונים

בתרביות שונות נבדק יחס התחלתי שונה בין מספר תאי האצות למספר תאי החיידקים, ובכל אחת מהתרביות התכנס היחס לאחר כ-7 ימים לסביבות 1:30, ונשמר כך לאורך כמה שבועות, כראיה לכך שקיימת בקרה הדדית בין שני האורגניזמים.

תרשים 19: היחס בין תאי האצות לתאי החיידקים לאורך זמן

הוספת ויטמין B12 ממקור חיצוני לתרבית הגדילה את היחס לטובת האצות, ואילו הוספת גליצרול כמקור פחמן הגדילה את היחס לטובת החיידקים.

תרשים 20: היחס בין תאי האצות לתאי החיידקים לאורך זמן. ריבוע – תוספת גליצרול; עיגול – תוספת ויטמין B12; אפור – ללא תוספת חיצונית

אין צורך במגע ישיר בין האורגניזמים, ומעבר פחמן וּויטמין B12 בתמיסה מתאפשר גם כאשר יש הפרדה פיזית בין תאי האצה לתאי החיידק.

תרשים 21: תאי האצה גדלים סביב המבחנה עם החיידקים למרות שהנקבים במבחנה קטנים מגודל תאי החיידק

גדילת האצה הייתה טובה יותר ככל שהקרבה לתאי החיידקים הייתה גדולה יותר, אך כאשר החיידק קיבל אספקת פחמן חיצונית, לא הייתה חשיבות למרחק והסימביוזה עם האצה הייתה מינימלית.

תרשים 22: תאי האצה לאחר 16 יום כתלות במרחק ממקור הוויטמין. שמאל – תמיסת ויטמין B12; אמצע – החיידק; ימין – החיידק עם מקור פחמן

דיון ומסקנות

שלושת מיני האצות שנבדקו במחקר יכולים לצרוך ויטמין B12 מחיידקים שמייצרים את הוויטמין. בהעדר מקור פחמן, החיידקים מנצלים את יכולת הפוטוסינתזה של האצות כדי לקבל פחמן בתמורה לוויטמין B12. עם זאת, לא כל שילוב בין האצות לחיידקים מניב שגשוג לאורך זמן של האורגניזמים, כראיה לכך שמערכת היחסים הסימביוטית דורשת ספציפיות רבה. באופן פרטני, האצה Lobomonas rostrata לא הייתה מסוגלת לגדול ללא החיידק Mesorhizobium loti בהעדר מקור חיצוני לוויטמין B12, ומהעבר השני, החיידק לא היה מסוגל לגדול ללא האצה בהעדר מקור חיצוני לפחמן. מערכת היחסים הסימביוטית היא פקולטטיבית, כלומר כאשר אחד האורגניזמים יקבל את הנוטריאנט הדרוש לו ממקור חיצוני, הוא יפחית במידה רבה את תמיכתו באורגניזם השני.

8. סיכום

בימינו עולה המודעות התזונתית והבריאותית ורבים מבינים שבעיות בריאותיות רבות נובעות מאורח חיים לקוי ולא מגנטיקה, חיידקים או וירוסים. אחת הסוגיות הבוערות בתחום היא מחסור בוויטמין B12, שמשפיע על שיעורים הולכים וגדלים באוכלוסייה, בעיקר אנשים מבוגרים, ונובע בעיקר מבעיות ספיגה, פגיעות נפוצות במערכת העיכול וצריכה לא מספקת של הוויטמין, לאור העובדה שגם המקורות הנפוצים לכאורה לוויטמין B12 מכילים כנראה כמויות הרבה יותר קטנות מהידוע.

היות שצמחים לא יכולים לסנתז ויטמין B12 ונראה שאין להם צורך בו, השתרשה ההשערה שבצמחים לא ניתן למצוא כלל את הוויטמין. עם זאת, צמחים בהחלט יכולים לספוג את הוויטמין ולצבור אותו בתאיהם. נוכחות ויטמין B12 בצמחים נובעת בראש ובראשונה מסימביוזה בין חיידקים שמסנתזים את הוויטמין לצמחים – במזונות מותססים שבהם החיידק שמסנתז את הוויטמין משמש כחלק מתהליך ההתססה, באצות, שבהן הוויטמין דרוש למסלולים מטבוליים, ובצמחים עילאיים בעלי סימביוזה לחיידקים מקבעי חנקן. לאור הראיות הללו והעובדה שניתן להעשיר צמחים באופן מלאכותי בוויטמין או בדשן אורגני שמכיל את הוויטמין, קיים פוטנציאל רב להגדלת צריכת ויטמין B12 בבני אדם באמצעות מזונות מן הצומח.

9. הצעות למחקרים עתידיים

• כיצד משפיעים תנאים שונים של התססה על ירקות מוחמצים – סטריליזציה, כמות מלח, pH, תוספת מקור פחמן כמו גלוקוז, סוגי חיידקים.

• זיהוי מקורות שונים לוויטמין B12 במוצרים מסחריים שמשווקים בישראל: אצות נורי, חסת ים, פטריות, מוצרים מותססים וכבושים.

• בדיקת תכולת ויטמין B12 בירקות ופירות אורגניים בחוות אורגניות בישראל שמשתמשות בדשנים שונים ושיטות גידול שונות וזיהוי התנאים האופטימליים לספיגת הוויטמין על ידי הצמחים.

• באיזו מידה צריכת מקורות צמחיים שונים לוויטמין B12 מעלה את רמתו בדם לאורך תקופה מסוימת.

• האם פטריות שמפיניון שגדלות על זבל עופות סופגות ממנו ויטמין B12.

• האם צמחים שונים יספגו כמויות שונות של ויטמין B12 כאשר הוא מוסף מלאכותית לתמיסת הגידול.

• האם הוספת חיידקי אקטינובקטריה למצע של ירקות תשפיע על ספיגת ויטמין B12.

• האם הכנסת צמח למצבי עקה שמגדילים הפרשת סטריגולקטונים שמעודדים פעילות חיידקית יכולה להשפיע על ייצור ויטמין B12.

• האם תכולה שונה של חיידקי מעיים משפיעה באופן שונה על ספיגת הוויטמין מהמזון. למשל חיידקים שצורכים אך לא מייצרים ויטמין B12 כמו אי-קולי.

• האם ניתן בהנדסה גנטית לשנות את הגן MetE בצמחים ל-MetH כדי לוודא שהם צורכים וסופגים ויטמין B12.

10. ביבליוגרפיה

 1f. F. Watanabe; Y. Yabuta; T. Bito; F. Teng. Vitamin B12-Containing Plant Food Sources for Vegetarians. Nutrients 2014, 6, 1861-1873י.

2f. F. Watanabe; Y. Yabuta; Y. Tanioka; T. Bito. Biologically Active Vitamin B12 Compounds in Foods for Preventing Deficiency among Vegetarians and Elderly Subjects. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 6769−6775י.

3f. G. Rizzo; A.S. Laganà; A.M.C. Rapisarda; G.M.G. La Ferrera; M. Buscema; P. Rossetti; A. Nigro; V. Muscia; G. Valenti; F. Sapia; G. Sarpietro; M. Zigarelli; S.G. Vitale. Vitamin B12 among Vegetarians: Status, Assessment and Supplementation. Nutrients 2016, 8, 767.

4f. Helliwell, K.E.; Wheeler, G.L.; Leptos, K.C.; Goldstein, R.E.; Smith, A.G. Insights into the evolution of vitamin B12 auxotrophy from sequenced algal genomes. Mol. Biol. Evol. 2011, 28, 2921−2933.

5f. Lachner, C.; Steinle, N.I.; Regenold, W.T. The neuropsychiatry of vitamin B12 deficiency in elderly patients. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 2012, 24, 5−15.

6f. Baik, H.W.; Russell, R.M. Vitamin B12 deficiency in the elderly. Annu. Rev. Nutr. 1999, 19, 357−377.

7f. S. Sharma; T. Sheehy; L.N. Kolonel. Contribution of meat to vitamin B-12, iron, and zinc intakes in five ethnic groups in the U.S.: Implications for developing food-based dietary guidelines. J Hum Nutr Diet. 2013 April ; 26(2): 156–168.

8f. Tucker, K.L.; Olson, B.; Bakun, P.; Dallal, G.E.; Selhub, J.; Rosenberg, I.H. Breakfast cereal fortified with folic acid, vitamin B6, and vitamin B12 increases vitamin concentrations and reduces homocysteine concentrations: A randomized trial. Am. J. Clin. Nutr. 2004, 79, 805−811.

9f. Squires, M.W.; Naber, E.C. Vitamin profiles of eggs as indicators of nutritional status in the laying hen: Vitamin B12 study. Poult. Sci. 1992, 71, 275–282.

10f. Gille D; Schmid A. Vitamin B12 in meat and dairy products. Nutr Rev. 2015 Feb;73(2):106-15.

11f. Doscherholmen, A.; McMahon, J.; Ripley, D. Inhibitory effect of eggs on vitamin B12 absorption: Description of a simple ovalbumin 57Co vitamin B12 absorption test. Br. J. Haematol. 1976, 33, 261–272.

12f. F. Watanabe; Y. Yabuta; Y. Tanioka; T. Bito. Biologically Active Vitamin B12 Compounds in Foods for Preventing Deficiency among Vegetarians and Elderly Subjects. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 6769−6775.

13f. Stabler, S.P.; Brass, E.P.; Marcell, P.D.; Allen, R.H. Inhibition of cobalamin-dependent enzymes by cobalamin analogues in rats. J. Clin. Investig. 1991, 87, 1422−1430.

14f. F. Watanabe; K. Abe; T. Fujita; M. Goto; M. Hiemori; Y. Nakano. Effects of Microwave Heating on the Loss of Vitamin B12 in Foods. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 206-210.

15f. Arkbage, K.; Witthoft, C.; Fonden, R.; Jagerstad, M. Retention of vitamin B12 during manufacture of six fermented dairy products using a validated radio protein-binding assay. Int. Dairy J. 2003, 13, 101–109.

16f. Carmel, R. How I treat cobalamin (vitamin B12) deficiency. Blood 2008, 112, 2214–2221.

17f. Takenaka, S.; Sugiyama, S.; Watanabe, F.; Abe, K.; Tamura, Y.; Nakano, Y. Effects of Carnosine and Anserine on the Destruction of Vitamin B12 with Vitamin C in the Presence of Copper. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997, 61, 2137–2139.

18f. Watanabe, F.; Katsura, H.; Takenaka, S.; Fujita, T.; Abe, K.; Tamura, Y.; Nakatsuka, T.; Nakano, Y. Pseudovitamin B12 is the predominate cobamide of an algal health food, spirulina tablets. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4736–4741.

19f. Gu, Q.; Zhang, C.; Song, D.; Li, P.; Zhu, X. Enhancing vitamin B12 content in soy-yogurt by Lactobacillus reuteri. Int. J. Food Microbiol. 2015, 206, 56–59.

20f. Nout, M.J.R.; Rombouts, F.M. Recent developments in tempe research. J. Appl. Bacteriol. 1990, 69, 609−633.

21f. Kittaka-Katsura, H.; Ebara, S.; Watanabe, F.; Nakano, Y. Characterization of corrinoid compounds from a Japanese black tea (Batabata-cha) fermented by bacteria. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 909–911.

22f. Babuchowski, A.; Laniewska-Moroz, L.; Warminska-Radyko, I. Propionibacteria in fermented vegetables. Lait 1999, 79, 113−124.

23f. Gupta, U.; Rudramma, Rati E.R.; Joseph, R. Nutritional quality of lactic fermented bitter gourd and fenugreek leaves. Int. J. Food Sci. Nutr. 1998, 49, 101−108.

24f. Chung Shil Kwak; Mee Sook Lee; Se In Oh; Sang Chul Park. Discovery of Novel Sources of Vitamin B12 in Traditional Korean Foods from Nutritional Surveys of Centenarians. Curr Gerontol Geriatr Res. 2010; 2010: 374897.

25f. A.G. Smith; M.T. Croft; M. Moulin; M.E. Webb. Plants need their vitamins too. Current Opinion in Plant Biology 2007, 10:266–275.

26f. Hashimoto, Y; Maeda, Y. (1953): Animal protein factor (APF) and vitamin B12 in marine products-II. Seaweeds. Nippon Suisan Gakkaishi (Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish.), 19, 141-144.2

27f. Yamada, S.; Shibata, Y.; Takayama, M.; Narita, Y.; Sugiwara, K.; Fukuda, M. Content and characteristics of vitamin B12 in some seaweeds. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1997, 42, 497−505.

28f. Watanabe, F.; Takenaka, S.; Katsura, H.; Masumder, S.A.; Abe, K.; Tamura, Y.; Nakano, Y. Dried green and purple lavers (nori) contain substantial amounts of biologically active vitamin B12 but less of dietary iodine relative to other edible seaweeds. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2341−2343.

29f. Watanabe, F.; Takenaka, S.; Katsura, H.; Miyamoto, E.; Abe, K.; Tamura, Y.; Nakatsuka, T.; Nakano, Y. Characterization of a vitamin B12 compound in the edible purple laver, Porphyra yezoensis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000, 64, 2712–2715.

30f. Miyamoto, E.; Yabuta, Y.; Kwak, C.S.; Enomoto, T.; Watanabe, F. Characterization of vitamin B12 compounds from Korean purple laver (Porphyra sp.) products. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 2793−2796.

31f. Takenaka, S.; Sugiyama, S.; Ebara, S.; Miyamoto, E.; Abe, K.; Tamura, Y.; Watanabe, F.; Tsuyama, S.; Nakano, Y. Feeding dried purple laver (nori) to vitamin B12-deficient rats significantly improves vitamin B12 status. Br. J. Nutr. 2001, 85, 699–703.

32f. Kittaka-Katsura, H.; Fujita, T.; Watanabe, F.; Nakano, Y. Purification and characterization of a corrinoid-compound from chlorella tablets as an algal health food. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 4994–4997.

33f. Watanabe, F.; Schwarz, J.; Takenaka, S.; Miyamoto, E.; Ohishi, N.; Nelle, E.; Hochstrasser, R.; Yabuta, Y. Characterization of vitamin B12 compounds in the wild edible mushrooms black trumpet (Craterellus cornucopioides) and golden chanterelle (Cantharellus cibarius). J. Nutr. Sci. Vitaminol. 2012, 58, 438−441.

34f. Bito, T.; Teng, F.; Ohishi, N.; Takenaka, S.; Miyamoto, E.; Sakuno, E.; Terashima, K.; Yabuta, Y.; Watanabe, F. Characterization of vitamin B12 compounds in the fruiting bodies of shiitake mushroom (Lentinula edodes) and bed logs after fruiting of the mushroom. Mycoscience 2014.

35f. Watanabe, F. Vitamin B12 sources and bioavailability. Exp. Biol. Med. 2007, 232, 1266–1274.

36f. Kittaka-Katsura, H.; Watanabe, F.; Nakano, Y. Occurrence of vitamin B12 in green, blue, red, and black tea leaves. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 2004, 50, 438–440.

37f. H. Suzuki. Serum Vitamin B12 Levels in Young Vegans Who Eat Brown Rice. J. Nutrr. Sci. Vitaminol., 41, 587-594, 1995.

38f. A. Mozafar; J.J. Oertli. Uptake of a microbially-produced vitamin (B12) by soybean roots. Plant and Soil 139: 23-30, 1992.

39f. A. Mozafar. Enrichment of some B-vitamins in plants with application of organic fertilizers. Plant and Soil 167: 305-311, 1994.

40f. K. Sato; Y. Kudo; K. Muramatsu. Incorporation of a high level of vitamin B12 into a vegetable, kaiware daikon (Japanese radish sprout), by the absorption from its seeds. Biochim Biophys Acta. 2004 Jun 11;1672(3):135-7.

41f. M. Nakos; I. Pepelanova; S. Beutel; U. Krings; R.G. Berger; T. Scheper. Isolation and analysis of vitamin B12 from plant samples. Food Chemistry 216 (2017) 301–308

42f. V. Giassi; C. Kiritani; K.C. Kupper. Bacteria as growth-promoting agents for citrus rootstocks. Microbiol Res. 2016 Sep;190:46-54.

הגב

avatar
3000
  Subscribe  
הרשמה לעדכונים